معرفی تکنیک:

‏Real-time PCR  تکنیکی برای مشاهده ی لحظه به لحظه فرایند تکثیر اسید نوکلئیک می باشد. مشکلات و نواقص عدیده موجود در PCR های معمول، همراه با نیاز به یک روش تعیین کمیِ دقیق، زمینه گشایش عرصه ای نوین در تکنیک PCR را فرآهم آورد. در این تکنیک از رنگهایی استفاده می شود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA ، نور فلورسانس منتشر می کنند.

بنابراین در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان ثبت جذب فلورسانس در واکنش توسط شناساگر دستگاه افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNA هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه می شوند.

مولکول های گزارشگرِ فلوروسنت یا به صورت رنگ هایی می باشند که به DNA دو رشته ای متصل می شوند، مانند SYBR® Green و یا بصورت شناساگرهای توالی های خاص مانند TaqMan® Probes می باشند.

تفاوت Real-Time PCR با PCR روتین:

تفاوت اصلی RT-PCR با PCR روتین، استفاده از آنزیم RT ویروس های خانواده رتروویریده مثل AMV و MMLV می باشد. آنزیم RT دارای خاصیت غلط گیری و سه پریم به پنج پریم اگزونوکلئازی نمی باشد. میزان خطای آنزیم AMV RT با توجه به سرعت بیشتر آن دو برابر MMLV RT می باشد. با توجه به دمای بهینه ی فعالیت AMV RT در دمای 42 الی 52 و دمای بهینه ی فعالیت آنزیم MMLV RT در دمای 37 درجه سانتیگراد، آنزیم AMV RT برای رونویسی معکوس الگوهای RNA غنی از GC مناسب تر است.

تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک PCR معمولی نیاز است در تکنیک Real time PCR (ریل تایم پی سی آر) هم بکار می‌رود، اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد.

به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه یا CT  گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را مورد تخمین قرار داد.

به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانه­ای می رسد، که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه (سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT  شناخته می شود.

مراحل ازمایشگاهی PCR :

واسرشت سازی دو رشته DNA : دراین مرحله DNA دو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود 95 درجه) به منظور به دست آوردن مولکول های DNA تک رشته ای, واسرشت می شود.

هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمر های الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNA تک رشته ای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود 40 تا 65 درجه هیبریداسیون صورت می گیرد.

طویل سازی(بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمراز در درجه حرارت حدود 72 درجه سانتی گراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد.

این مراحل پی درپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات DNA در هر سیکل دو برابر می شوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون(Amplicon) می گویند.

مراحل نموداری PCR :

در هر نمودار PCR سه مرحله قابل تشخیص است:

مرحله نمایی (صعودی): در هر سیکل در این مرحله محصولات مضاعف می شوند.

مرحله خطی: در این مرحله اجزای واکنش در حال مصرف شدن می باشند و واکنش به کندی پیش می رود و طول تولیدات در حال کاهش می باشند.

مرحله پلاتئو: واکنش متوقف شده است بیشتر محصولات ساخته نشده اند و تولیدات PCR رو به تنزل می باشند.

کاربردهای مهم روش real time PCR :

• بررسی ژنها بخصوص در مورد بیماریهای خود ایمنی و پاتوژنهایی نظیر لیشمانیا.
• بررسی میزان آنزیمهای کبدی برای متابولیز کردن داروی خاص
• شناسایی و تعیین Load عوامل عفونی به خصوص در تعیین دقیق عواملی چون HBV و HIV برای درمان افراد آلوده
• یک روش قوی برای کنترل و مقایسه میزان آلودگی میکروبی در غذا و دارو
• بررسی سرطانهای خونی و تعیین ریسک بازگشت آن در قبل، حین و بعد از مراحل درمان
• تعیین میزان موفقیت پیوند اعضا افراد با شاخص های ایمونولوژیک های ویژه
• تعیین دوز وکتور حاوی ژن مورد نظر در ژن درمانی و ارزیابی آن در هنگام ورود به سلولها یا بافت ها
• تشخیص ناقلین ناهنجاریهای کروموزومی مثل سندرم داون و دوشن
• تشخیص قبل از تولد و لانه گزینی ، تعیین subtype ویروسها و باکتریها در ژنوتایپینگ
• پی بردن به وجود یا عدم وجود نقص در LOH از طریق تعیین شمارش های کپی ژن مورد نظر
• تشخیص در جهشهای نقطهای در منطقه ای از ژن یا همان SNP

مزایای روش real time PCR :

• قابل مشاهده بودن تکثیر در هر زمان؛ به عبارتی فراهم آوردن مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش و امکان بررسی فرآیند تکثیر در هر سیکل
• قطع واکنش در هر زمان دلخواه بخاطر قابل مشاهده بودن روند PCR با این ویژگی میتوان به واکنش در صورت رفتن به حالت سکون یا عدم تکثیر خاتمه و از اتلاف وقت و هزینه صرفه جویی کرد.
• ‏قابل اندازه گیری بودن میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه با دارا بودن روشهای Absolute Quantification و Quantification Relative
• نیاز به زمان کم به دلیل بالا بودن انجام سرعت واکنش ها
• ‏بالا بودن محدوده تشخیص آن نسبت به روش PCR معمولی.

منابع:

dayaexir.com

codongeneticgroup.com

kmgostar.ir