کشت باکتری چیست؟

کشت باکتری یکی از روش های مهم در میکروبیولوژی می باشد که در آن با آماده سازی یک محیط کشت مناسب از نظر مواد مغذی میکروب ها، رشد داده می شوند. با استفاده از کشت میکروب ها در یک محیط کشت مناسب، می توان نوع و مقدار آن در یک نمونه آزمایشگاهی تعیین کرد. به عنوان نمونه وقتی یک نمونه ای از گلو برای آزمایش برداشته می شود، از لحاظ وجود میکروارگانیسم های ایجاد کننده استرپتوکوک در یک محیط کشت خاص مورد آزمایش قرار می گیرد. وقتی یک باکتری خاص شناسایی می شود باید یک محیط کشت خالص برای رشد آن فراهم شود.

ضرورت کشت باکتری :

با انجام آزمایشهای میکروسکوپی باکتری ها را نمی توان از هم تشخیص داد بنابراین با کشت نمونه های بالینی و انجام آزمایشهای بیوشیمیایی و سرولوژیک می توان شناسایی باکتری ها را انجام داد.

با شناسایی میکروب یا عاملی که باعث ایجاد بیماریهای عفونی شده میتوان مقاومت و همچنین حساسیت آنها را در برابر داروهایی که برای درمان آنها تجویز می شود را تعیین کرد. با کشت میکروبها و تهیهی آنتی ژن از آن ها، می توان بیماریهای عفونی را در آزمایشهای سرمی تشخیص داد. با کشت باکتریها میتوان سرم و واکسن از آن ها تهیه کرد. همچنین برای ساخت آنتی بیوتیک ها و فرآورده های بیولوژیکی از باکتریها آن ها کشت داده می شوند و کشت میکروبها باید در هود باکتریولوژی کنار شعله جایی باشد که هوا در آن جا جریان نداشته باشد تا محیط کشت و رشد باکتریها توسط میکروبهای هوا آلوده نشود.

انواع محیط کشتها از لحاظ فیزیکی :

محیط کشت جامد (Solid Media): این محیط کشت دارای آگار می باشد که همین آگار باعث انعقاد و جامد شدن محیط کشت می‌شود. از این محیط کشت جهت بررسی خصوصیات باکتری، تشکیل کلونی، شمارش باکتری ها و … استفاده می‌کنند که هم در ظروف پلیت و هم لوله آزمایش قابل تهیه می‌باشد. مثال  نوترین آگار محیط کشت نیمه جامد (semisolid Media): این محیط ها درصد کمی آگار مثلا نیم درصد، دارند و نیمه جامد می مانند. از آن ها به عنوان محیط انتقالی استفاده می شود. مثل SIM

محیط کشت مایع : (Liquid Media ) این محیط کشت بدون آگار است به همین دلیل مایع بوده و در لوله آزمایش یا فلاسک تهیه می‌شود و برای رشد باکتری ها و مطالعه فرآیند تخمیری کاربرد دارد. مثل نوترینت براث

انواع محیط کشت از لحاظ کاربرد در آزمایشگاه :

محیط کشت پایه( Basic media ) : اساس ساخت انواع محیط های رشد، محیط رشد پایه است که از نظر مواد مغذی دارای کمترین حد است. این محیط برای رشد میکروب هایی مناسب است که محیط های تخصصی برای رشد و تکثیر لازم ندارند. این محیط برای رشد انواع سلول ها مناسب است. محیط کشت نوترین آگار از این نوع محیط کشت است.

محیط کشت غنی شده (Enriched Media) : این محیط ها به واسطه اضافه کردن خون یا سرم به محیط های کشت ساده فراهم می شوند.این محیط ها می توانند رشد یک سری باکتری های پر نیاز را فراهم کنند مثل محیط بلاد آگار یا سرم لفلر که مورد اخیر جهت کشت باسیل دیفتری به کار می رود.

محیط کشت انتخابی (Selective Media) : مکانیزم عملکرد این محیط کشت به گونه ای است که با استفاده از ماده مهار کننده ، به جز ارگانیسم مورد نظر ، رشد باقی ارگانیسم ها مهار میشود.به همن دلیل نام اتخابی برای این محیط کشت به کار برده میشود.این محیط کشت قابلیت دارد تا فقط یک ارگانیسم را رشد دهد.این محیط کشت در مواردی مورد استفاده قرار میگیرد که رشد برای سایر ارگانیسم ها مضر باشد.

محیط کشت افتراقی (Differential Media):  این دسته از محیط های کشت، محیط کشت تشخیصی بوده و به علت دارا بودن ترکیبات خاص و مواد ضد میکروبی در اجزای خود منجر به تمایز و جداسازی باکتری میشود. مانند محیط M.C و EMB این محیط ها دارای املاح صفراوی – قند -معرف های شیمیایی هستند که باکتری لاکتوز مثبت بر روی آن ها کلنی صورتی رنگ و لاکتوز منفی ها مثل سالمونلا و شیگلا کلنی سفید رنگ تشکیل می‌دهد.

محیط کشت ترابری (Transport Media) : وقتی نمونه های بالینی آماده می شود برای انتقال به آزمایشگاه از این محیط های کشت استفاده می شود. چون در انتقال نمونه ها ممکن است آن ها خشک شوند و یا باکتری های ناخواسته رشد کنند، و یا نمونه آلوده شود. همچنین با افزودن زغال مانع رشد باکتری های ناخواسته می شویم. مثال کری بلیر

محیط کشت کامل  :(Complete Media) این نوع محیط کشت دارای تمامی مواد لازم برای رشد باکتری هاست و مواد ضد میکروبی، مهار کننده و اندیکاتور (شاخص ) ندارد یعنی با رشد باکتری های مختلف روی آن هیچ تغییر رنگی مشاهده نمی‌شود و حدود ۸۰ درصد باکتری ها در آن رشد می‌کنند.  مثال محیط کشت P.C.A پلیت کانت آگار

محیط های کشت پر کاربرد :

محیط های رشدی که برای رشد میکروارگانیسم ها به کار گرفته می شوند بسیار فراوان است. در این جا به چند نمونه اشاره می کنیم.

محیط  شکلات آگار (Chocolate Agar) : اگر به محیط پایه آگار خوندار، هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتیگراد باشد، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید. در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.

محیط  آگار خون دار (Blood Agar ) : یک محیط کشت عمومی است برای تکثیر و جداسازی باکتری های بیماری زا به خصوص باکتری هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند. کاربرد دیگر آن پیدا کردن همولیزین در باکتری ها می باشد. همولیز با توجه به نوع باکتری به ۳ دسته تقسیم می شود. همولیز کامل b، همولیز ناقص a، عدم همولیز y.

محیط  مک کانکی آگار(Macconkey agar ) : محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری های گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شوند. باکتری های تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبت ها( کلنی هایی به رنگ ارغوانی و باکتری هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی ها( کلنیهایی زرد کاهی ایجاد می نمایند.

محیط SIM ( Sulfide Indol motility ):محیط کشت SIM دارای ترکیباتی همچون تریپتون ، پپتون، سولفات آمونیوم آهن، تی سولفات سدیم، آگار و بافت حیوانی جهت تأمین اسید آمینه و مواد مغذی برای رشد باکتری هاست. اساس تمایز باکتری ها در محیط کشت SIM بر اساس حرکت، تولید اندول و سولفید می‌باشد. قوام نیمه جامد این محیط اجازه پخش شدن و درنتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می‌دهد پس از این محیط کشت برای تمایز باکتری روده ای استفاده می‌شود نه تشخیص آن ها.

محیط  ائوزین متیلن بلو (Eosin methylen blue ): آگار ائوزین متیلن بلو (EMB) یک محیط کشت انتخابی و افتراقی است. این یک محیط کشت انتخابی برای باکتری های گرم منفی است.  و معمولاً برای جداسازی و افتراق کلنی های باکتریایی و کلنی های باکتریایی جدا شده از نمونه ی مدفوع استفاده می شود. محیط کشت ائوزین متیلن بلو دارای ترکیباتی همچون متیلن بلو، پیتون و لاکتوز است، همچنین فاقد املاح صفراوی است .

محیط (Triple suger iron agar): محیط کشت TSI محیطی جامد و افتراقی است و برای تشخیص باکتری‌های روده‌ای (خانواده انتروباکتریاسه ) به‌ کار می‌رود.این محیط کشت  به صورت شیب‌دار و درون لوله ای است.محیط موردنظر دارای ۱ درصد لاکتوز، ۱ درصد سوکروز، ۰٫۱ درصد گلوکز (دکستروز(،پپتون، تیوسولفات، آهن و فنل رد است و  PH محیط کشت فوق حدودا ۸/۴-۴/۸ است.اختلاف در غلظت‌های متفاوت قندها در این محیط سبب تمایز باکتری‌های تخمیر کننده براساس نوع قند مصرفی می‌باشد.تخمیر کربوهیدرات منجر به تولید گاز و تغییر در رنگ محیط کشت از قرمز به زرد می‌شود. کشت در محیط  TSI به صورت عمقی و خطی است.

محیط  نوترینت آگار (Nutrient Agar) : محیط کشت نوترینت آگار محیطی جامد و دارای مواد مغذی و لازم برای رشد دادن میکروارگانیسم ها و همچنین شمارش آن ها در آب، فاضلاب و مواد دیگر می باشد. این محیط که یک محیط کشت میکروب شناسی می باشد حتی در دماهای بالا نیز جامد می باشد و برای رشد قارچ ها و باکتری های که سخت پسند نیستند و به شرایط سخت محیطی احتیاج ندارند، مناسب است. در این محیط رشد باکتری ها و تشکیل کلونی های آن در سطح انجام می شود. همچنین از خصوصیات آن داشتن PH خنثی در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد است.

محیط (Salmonella Shigella ) SS: یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد. این محیط حاوی تیو سولفات سدیم بعنوان منبع گوگرد و آهن فریک به عنوان منبع آهن می باشد. همچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می باشد. اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H2Sتولید نموده کهH2S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه های سیاه رنگ می نماید. اکثر باکتری های لاکتوز مانند سالمونلا ها H2S مثبت میباشند.

محیط کشت سیمون سیترات آگار(Simmon citrate agar ): محیط کشت سیمون سیترات آگار حاوی آمونیوم دی هیدروژن فسفات و سدیم سیترات و همچنین معرف بازی برمو تیمول بلو می‌باشد. این محیط کشت دارای منابع خوبی از نیتروژن و کربن است و تنها میکروارگانیسم هایی که توانایی مصرف سیترات و استفاده از کربن را دارند در این محیط رشد می‌کنند و در مجاورت رنگ برمو تیمول بلو به رنگ آبی در می‌آیند. مثل باکتری های گرم منفی که از این محیط کشت جهت شناسایی اشرشیا ایکولای و انتروباکتر ائروژنز نیز استفاده می‌کنند.

محیط مانیتول سالت آگار(Mannitol Salt Agar) : مانیتول نمک آگار یا MSA یک محیط رشد انتخابی و افتراقی است که معمولاً در میکروب‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرد و رشد گروهی از باکتری‌های خاص را تقویت می‌کند در حالی که جلوی رشد سایر آن‌ها را می‌گیرد. این محیط به عنوان یکی از روش‌های تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا در مدت زمان کوتاه در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی اهمیت دارد. وجود این غلظت از نمک باعث می‌شود MSA در برابر بیشتر باکتری‌های گرم منفی انتخابی و برای برخی از باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوک، انتروکوک و میکروکوکاسه) قابل تحمل باشد. استافیلوکوکوس اورئوس کلونی‌های زرد با مناطق زرد تولید می‌کند، در حالی که سایر استافیلوکوک‌های منفی کوآگولاز کلنی های کوچک صورتی یا قرمز تولید می‌کنند و هیچ تغییری در رنگ محیط ایجاد نمی‌کنند. اگر ارگانیسم بتواند مانیتول را تخمیر کند، یک محصول جانبی اسیدی ایجاد می‌شود که باعث زرد شدن فنل قرمز موجود در آگار می‌شود. این محیط برای جداسازی انتخابی گونه‌های استافیلوکوک در بیماری احتمالی (pp) کاربرد دارد.

محیط ستریماید آگار (CETRIMIDE AGAR BASE): این محیط کشت  برای جداسازی انتخابی و شناسایی سودوموناس آئروژینوزا تعبیه شده است. محیط کشت ستریماید آگار دارای فرمولی با تکنیک آگار است که با اضافه کردن ستریماید (استیل تری متیل آمونیوم برمید) برای مهار انتخابی ارگانیسم های غیر از سودوموناس آئروژینوزا اصلاح شده است.        (P. aeruginosa ) تنها گونه سودوموناس یا گرم منفی میله ایی ، شناخته شده برای برای دفع پیوسیانین است.بنابراین این محیط کشت یک محیط ارزشمند در شناسایی این ارگانیسم است. از این محیط کشت به طور گسترده در بررسی لوازم ارایشی بهداشتی ، نمونه های بالینی و ارزیابی اثربخشی ضدعفونی کننده های علیه این ارگانیسم (P. aeruginosa ) استفاده میشود.

محیط آگار بیرد – پارکر  (Baird-Parker Agar): نوعی آگار است که برای جداسازی انتخابی گونه‌های گرم مثبت استافیلوکوک استفاده می‌شود. این ماده حاوی لیتیوم کلراید و تلوریت است تا از رشد فلور میکروبی جایگزین جلوگیری کند، در حالی که پیروات و گلایسین موجود باعث رشد استافیلوکوک می‌شود. کلونی‌های استافیلوکوک به رنگ سیاه با مناطق روشن ایجاد شده در اطراف خود نشان می‌دهند.

انواع روش های کشت:

کشت باکتری در محیط جامد داخل لوله

برای کشت باکتری از لوله استفاده می کنیم. در این روش ابتدا بعد از استریل کردن لوله پلاتینی، از همان انتهای پلاتینی روی شعله می گیریم تا سرخ شود. همچنین دسته فلزی آن را با عبور از روی شعله استریل می کنیم. بعد پنبه روی لوله را با انگشت کوچک حلقه کرده روی کف دست، بر می داریم، هوای داخل لوله را بلافاصله با عبور دهانه لوله از روی شعله، گرم می کنیم تا آلوده نشود.

بعد از استریل وقتی حلقه پلاتین سرد شد، با وارد کردن داخل لوله می توان مقداری میکروب را خارج کرده و آن را در محیط مورد نظر کشت می دهیم. برای وارد کردن این نمونه داخل لوله کشت، از انتهای یک سانتی متری انتهای لوله، خط هایی با میله پلاتینی حاوی باکتری روی تمام سطح ژلوز کشیده می شود. پنبه ی آن را بعد از عبور سر لوله از شعله، می گذاریم. بعد از تمام این مراحل محیط محیط کشت را داخل انکوباتور می گذاریم. حلقه پلاتین آلوده به باکتری، برای جلوگیری از پراکنده شدن به اطراف قبل از استریل کامل شدن، باید به تدریج به شعله نزدیک شود.

کشت باکتری به روش عمقی در محیط جامد ایستاده و شیبدار در لوله

در این روش به حالت مذاب محیط کشت جامد (آگاردار) را داخل لوله ریخته و با قرار دادن در حالت سرد می شود و بعد از آغشته کردن میله پلاتینی نیزه ای شکل به باکتری، آن را در محیط کشت به طور عمقی فرو برده و بدون تغییر آن را خارج می کنند و داخل انکوباتور می گذارند. در محیط های کشت شیبدار، قبل از سرد شدن، محیط های کشت جامد به حالت شیبدار قرار داده می شوند و بعد از سرد شدن میله آغشته به باکتری را با حفظ شرایط تعادل، به طور مستقیم داخل بخش عمودی کرده و قبل از خارج کردن، روی سطح شیبدار مارپیچی می کشند.

کشت خطی در پلیت

در این روش ابتدا مقداری از باکتری را با استفاده از یک آنس استریل شده روی محیط پیش ریخته به شکل خط های موازی می کشند. با تقسیم کردن پلیت به چهار قسمت و کشیدن آنس آغشته به باکتری در هر قسمت و امتداد آن در قسمت بعدی در جهت مخالف و ادامه این کار، کلونی های تک به دست می آید. با کشیدن هر خط در هر قسمت تراکم باکتری ها کم می شود.

به طوریکه وقتی در قسمت اول وقتی تراکم کم است، ابتدای قسمت دوم شروع شده و تراکم کم و کمتر می شود تا این که در قسمت چهارم می توانیم به باکتری تکی و خالص برسیم. به باکتری های تکی و خالصی که با انجام درست این روش به دست می آید، باکتری مادری می گویند. در محیط کشت باکتریایی مایع، یکبار لوب داخل محیط حاوی باکتری شده و با ریختن روی محیط پیش ریخته، به صورت خط های موازی کشیده می شود.

کشت سطحی در پلیت

در این روش که بیشتر برای محیط های مایعی کاربرد دارد (شناسایی میکروارگانیسم های موجود در شیرهای مشکوک به آلودگی)، از محیط پیش ریخته استفاده می شود. در این روش با به کارگیری یک پیپت استریل مقداری از یک مایع با رقت معین برداشته و با استفاده از یک میله پخش کننده به داخل محیط پیش ریخته پخش می شود. کلونی های رشد یافته بعد از انکوباسیون در سطح محیط کشت قابل مشاهده خواهند بود. خشک بودن سطح محیط کشت در کشت سطحی مهم است.

کشت آمیخته در پلیت یا پورپلیت

سوسپانسیونی از باکتری در این روش کشت باید تهیه شود. ابتدا به میزان یک سی سی از محیط مایع با رقت معین، داخل ظرف پلیت می ریزند. در مرحله بعد با اضافه کردن ۱۵ تا ۲۰ سی سی از محیط کشت استریل شده با دمای ۴۵ درجه سانتی گراد، آن را به شکل عدد انگلیسی ۸ به صورت دورانی مخلوط می کنند. در کشت دو لایه سطح مخلوط را دوباره با لایه باریکی از همان محیط کشت می پوشانند.

کشت در محیط مایع

ابتدا درب محیط لوله یا پلیت را در جلوی شعله بردارید. در این روش نیز حلقه پلاتین را استریل کرده و بعد از آلوده کردن آن به باکتری، آن را به دیواره لوله ای که بعد از حرارت دادن، سرش را کج کرده اند، می سایند. باکتری ها بعد از راست کردن لوله وارد محیط می شوند. دهانه لوله نیز در اینجا بعد از عبور از شعله، استریل می شود.

در نمونه مایع، حلقه پر از مایع در محیط کشت مایع وارد می شود. بعد از وارد کردن میله آغشته به باکتری به محیط کشت، به آرامی هم زده می شود تا محیط همگنی به دست آید. با استریل کردن دهانه لوله، درب آن را گذاشته و در انکوباتور قرار می دهند. در انتها حلقه پلاتین سوزانده می شود و در جای خود قرار می گیرد.

روش ایزولیشن (جدا کردن باکتری ها)

در صورت وجود بیش از یک نوع باکتری، روش کشت با پرگنه مجزا به دست می آید تا خواص حیاتی هر کدام با برداشت از پرگنه خالص به دست آید. در این روش نیز محیط می تواند مایع یا جامد باشد و در پلیت انجام می شود.

منابع:

environmentalhealth.ir

atiyesalamat.com

zingapp.ir

blog.eaz.ir

blog.faradars.org

jahaneshimi.com